摘要

為研究丙酸鉻對生長奶牛葡萄糖利用的影響，采用重復拉丁方設計，對20頭11-14月齡的荷斯坦小母牛分別飼喂0，5，10和15毫克/天的丙酸鉻源的鉻。試驗包括2周的預飼期和4個分別為期2周的正飼期，每試驗期之間間隔以2周的調整期，試驗組和試驗期的設計平衡了潛在的持續(xù)效應，丙酸鉻添加于250克的玉米粉中逐頭飼喂。每個試驗期的第14天，試驗動物安裝預留頸靜脈插管，并于第二天早晨進行靜脈葡萄糖耐受測試。試驗期體重持續(xù)增長，各處理的體重及體況評分沒有變化；丙酸鉻提高了血清中的基礎葡萄糖含量，并降低了基礎胰島素和非酯脂肪酸（NEFA）水平，變化幅度與丙酸鉻的添加量呈二次方程關系；通過測定血糖的半衰期、降至最低點所需時間以及曲下線面積發(fā)現(xiàn)：丙酸鉻提高了葡萄糖的清除率；試驗全期，胰島素水平有降低的趨勢，但其清除率沒有變化；血清NEFA水平與葡萄水平呈負相關，故在此試驗中葡萄糖的升高伴隨著NEFA水平的降低；在第4個試驗期，對照組的胰島素水平比前幾個試驗期的對照組均低，這說明丙酸鉻的作用是長效的。本研究結果表明丙酸鉻提高了生長奶牛對葡萄糖的利用。


前言

三價鉻是動物必需微量元素之一，可提高胰島素的功能，促進胰島素敏感器官對葡萄糖的吸收（Anderson, 1987; NRC, 1997），其缺乏會導致胰島素抵抗和降低葡萄糖的耐受。鉻參與了胰島素信號的自身擴增，它結合到活性結構中的胰島素受體上，從而促進葡萄糖進入胰島素敏感細胞（Vincent, 2000,2001）。鉻被認為是與一種被稱為低分子量鉻結合因子的小肽結合起作用的，該結合物被建議命名為含鉻生物活性蛋白（Chromodulin）（Sun等, 2000; Vincent, 2000, 2001），此蛋白由氨基乙酸、半胱氨酸、天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽構成，并緊密結合了4個鉻離子（Vincent, 2000, 2001）。


研究表明鉻會對單胃動物和反芻動物產生一系列的影響，多數(shù)結果表明鉻可提高葡萄糖的耐受（NRC, 1997; Hayirli等, 2001; McNamara和Valdez, 2005）。與其它鉻源相比，有機鉻如丙酸鉻或蛋氨酸鉻的研究結果比較一致，可提高奶牛的葡萄糖利用、采食量以及產奶量（NRC, 1997; Hayirli等, 2001; McNamara和Valdez, 2005），大量的研究還發(fā)現(xiàn)丙酸鉻在生長豬和泌乳母豬中具有同樣的效果（Matthews等，2001, 2003; Shelton等, 2003）。


在奶牛產前21天至產后35天時飼喂丙酸鉻，脂肪組織中的脂肪合成速度增加，凈降解量降低，采食量和產奶量均得到了提高（McNamara和Valdez, 2005）。在進行丙酸鉻對泌乳奶牛的作用研究之前，有必要在生長牛中利用靜脈葡萄糖耐受測試（GTT）研究丙酸鉻對反芻動物可能的生物活性機制。本試驗的預期結果為：在靜脈GTT中，通過口服添加不同劑量的丙酸鉻會促進胰島素敏感組織對葡萄糖的吸收。

試驗動物與飼養(yǎng)

試驗動物為20頭245-375日齡[平均304±40(標準差)]，體況評分（BSC）為3-4的未產荷斯坦奶牛，試驗日期為2004.2.6-2004.6.27。試驗時氣候為正常的太平洋西北部內陸晚冬和春天性氣候，氣溫0-22℃，風情及雨情正常。試驗程序遵守“農業(yè)研究和教學中農業(yè)動物的護理和使用指南”（FASS，1999），并得到了“大學動物使用和護理委員會”的批準。試驗動物集中散養(yǎng)于四周封閉帶有部分頂棚的牛舍中。每欄飼養(yǎng)約20頭奶牛，提供2個引水器，每頭牛都至少有一塊飼喂場地，畜欄均設鎖定裝置以對每頭牛進行單獨飼喂和試驗操作。飼槽附件的水泥地每天刮掃一次，散養(yǎng)區(qū)域每周清掃一次并重新鋪設，如有必要，增加清掃次數(shù)。

試驗設計及操作

試驗采用有5重復的4×4重復拉丁方設計，試驗設計平衡了持續(xù)效應，如下：試驗開始前一個月零兩周，挑選試驗動物入欄，稱重并體況評分。根據(jù)體重分為5組，每個試驗處理隨機分配于各動物組。各試驗動物之間的體況得分差異很?。ㄆ骄?.4，最小3，最大4，標準差=0.37），故在分組中沒有考慮。

試驗全混日糧（TMR）組成為：45%燕麥和干草混合物、45%苜蓿草和10%谷物混合物，每天早上八點飼喂；每頭牛的飼喂量不予稱重，但每欄飼料的消耗量和剩余量稱重并記錄；每天早上七點清理剩料并安裝獨立的料桶以避免鄰近牛搶食含有丙酸鉻的玉米粉，根據(jù)試驗劑量將所丙酸鉻拌入250克的玉米粉中飼喂每頭奶牛，分別提供0，5，10和15毫克/天的丙酸鉻源的鉻（CrP; Kem TRACE Cr, 建明農業(yè)北美公司，德梅因，愛荷華州），觀察以確保每頭牛均采食干凈鉻添加物，然后取走料桶，正常飼喂全混日糧。在全部的1120頭*次的鉻飼喂中，共有6次拒絕采食。試驗全期及試驗結束后3周，仔細觀察試驗牛是否有嚴重的異常征兆或表現(xiàn)。

GTT

每個試驗期的第14天（下午一點到四點），將試驗牛轉至離母牛舍約100米的獸醫(yī)室，刮去頸靜脈附件的被毛并擦拭干凈皮膚，用5毫升的利多卡因（2%，無腎上腺素；Abbott實驗室，北芝加哥，伊利諾伊州）麻醉后，在頸靜脈中插入一根消毒的無熱源插管（Abbocath-T, Abbott實驗室）并縫合在皮膚上，插管每6個小時用含有10 IU肝磷脂的消毒無熱源生理鹽水沖洗一次，左右頸靜脈在不同的試驗期輪流使用。

試驗動物在獸醫(yī)室中鋪有稻草的牛舍中過夜，可采食全混日糧和飲水，次日清晨六點，清除飼料，但飲水自由，七點時進行葡萄糖耐受測試。灌注前的15，10和0分鐘時分別取血樣；然后將50%（質量/體積）的消毒無熱源葡萄糖溶液按0.45克葡萄糖/公斤體重0.75的劑量在1-2分鐘之內灌注完畢并用40毫升的生理鹽水沖洗靜脈插管。分別在灌注開始后的5，10，20，30，45，60，90，120和150分鐘時取血樣，每次取樣前后均要沖洗插管。樣品收集于含有氟化鈉的試管中，以防止血紅細胞葡萄糖氧化。試管迅速置于冰塊上并在1小時之內進行離心分離。

葡萄糖

血清中葡萄糖用Sigma公司的試劑盒（酶法）（試劑盒號：GAHK-20；Sigma，圣路易斯，密蘇里州）進行測定：葡萄糖在己糖激酶的催化下被三磷酸腺苷磷酸化，所生成的葡萄糖-6磷酸由葡萄糖-6磷酸脫氫酶催化被輔酶I氧化為6-磷酸-葡萄糖，在氧化過程中等摩爾的輔酶I被還原為還原性輔酶I，使得反應體系在340nm波長處的吸光率增加，從而可確定葡萄糖的濃度。血液樣本置于冰塊上并于1小時內離心分離，分離得到的血清樣品分裝后冷凍保存，每次測試時樣品只解凍1次。經(jīng)按“國家臨床實驗室標準委員會”（NSSLS，2003，2004）的指南進行驗證，表明用該方法處理牛血清是可信的。

NEFA

血清中的NEFA用Wako化學制品公司的NEFA-C試劑盒（里士滿，弗吉利亞州；經(jīng)過改進和驗證后，該法需要更少的血清樣本量且敏感性提高）進行酶法測定（McNamara和Hillers, 1986; McNamara,1988; Smith和McNamara,1989）。

胰島素

胰島素用“診斷系統(tǒng)實驗室”（Webster，德克薩斯州）的KSL-1600試劑盒進行同位素放射免疫法測定。試驗全期的所有樣本均重復測試，每次測試時均制作標準曲線（Nakagawa等，1973；Hwang等，1985；DSL-1600技術手冊）。

試驗采用4×4重復拉丁方設計（表一），包括2周的預飼期和4個各為期2周的正飼期，每個試驗期之間間隔以2周的調整期，試驗設計平衡了持續(xù)效應，每個處理之后的另一個處理只進行一次（Steel和Torrie, 1980），處理隨機分配于試驗期和試驗動物。除了胰島素變量，GTT數(shù)據(jù)最終采用以下模型進行分析：

y = μ + B + R_i + C_j + T_k + S_l + error_ijkl

其中，μ為平均值，B為協(xié)變量（基礎葡萄糖濃度、胰島素或NEFA；葡萄糖灌注前3個點的平均值），R為行（動物）效應，C為列（試驗期）效應，T為處理效應，S為區(qū)組（重復）效應。組內動物的差異及其互作在原始模型中進行了分析，由于其不顯著而沒有納入到最終模型中。胰島素在所有的測試中均存在試驗期×處理的互作作用，模型包含了該效應。除組內動物因素之外，其它所有的效應都被認為是確定的。

1 原始設計試驗期1的血清葡萄糖測試之后，原始設計中的試驗期2已經(jīng)開始，在還沒有進行靜脈測試時，發(fā)現(xiàn)試驗期1所采用的葡萄糖灌注量過低。調整葡萄糖灌注量并在原始設計基礎上繼續(xù)試驗，原始設計中的試驗期0在新試驗中以試驗期4重復進行。

第1個試驗期結束后，在第2個試驗期的GTT之前，分析發(fā)現(xiàn)葡萄糖的灌注量（0.15克/公斤體重^0.75）不足，難以達到預期結果。本試驗之前沒有此年齡的小母牛的GTT報告，所以試驗中所采用的灌注量參考的是成年動物的研究報告（Hayirli等，2001），但結果表明此劑量太低，而此時，第2個試驗期已經(jīng)開始且沒有理由停止或重新設計并開始試驗，所以從此時間點開始，葡萄糖灌注量提高到有關犢牛的研究報告水平（0.45克/公斤體重^0.75）（DePew等，1998；Bunting等，2000）。于是，將原始試驗設計中的第1個試驗期的數(shù)據(jù)從最終分析中舍棄，原始設計中第1個試驗期的試驗組將被重新設計到第5個試驗期中，以此完成整個試驗。如此，最終的設計為完全拉丁方設計，每個試驗期完成每個處理1次。

對GTT數(shù)據(jù)中葡萄糖和胰島素變量的分析包括基礎值（灌注前15，10和0分鐘樣本的平均值）、峰值、最低值、清除率（CR）、曲線下面積（AUC；梯形法）、半衰期（t_1/2）以及回到代表真實值的基礎值所需時間（T）。NEFA數(shù)據(jù)以單值的形式給出，測試每個時間點的濃度作為基礎值（灌注前的平均值）和響應值（灌注后平均值減去灌注前平均值）。由于NEFA的變化為3步響應（開始由于試驗操作而升高，進而隨著血糖和胰島素水平的增加而降低，最后升高至基礎值）且沒有適合的處理因素來衡量，所以在統(tǒng)計模型中沒有進一步分析這些數(shù)據(jù)。

體重與體況

生長速度為飼喂12-14%蛋白含量日糧的荷斯坦后備奶牛典型的生長速度（見表二），與預期一致，在本短期試驗內，丙酸鉻對體重沒有顯著影響。同樣，體況得分（5分制）也沒有明顯變化（表二）。

1 處理分別為對照組（0 毫克鉻）、5、10或15毫克/天丙酸鉻源的鉻。各測定項目均沒有顯著差異（P>0.05）.

對葡萄糖的影響

10和15毫克鉻/天處理組的基礎葡萄糖水平有提高的趨勢（表三，圖一），葡萄糖濃度水平處于已報道的泌乳牛和犢牛范圍之內（Bunting等，2000；McNara和Valdez，2005）。與對照組相比，所有的指標均表明GTT測試期各處理組的葡萄糖清除率明顯提高（CR，T，t_1/2和AUC；表三，圖1）。3個處理組的AUC降低（即更快的清除率）了36%（P=0.097）。動物間葡萄糖水平的變化差異是非常大的，據(jù)其它相關報道，發(fā)生10-20%的變化即意味著生理上發(fā)生了顯著變化（Bunting等，2000；Hayirli等，2001），與此相比，本試驗葡萄糖清除率的變化非常顯著，此結果意味著主要胰島素敏感組織、骨胳肌和脂肪組織對葡萄糖的吸收速度增加。

表三 丙酸鉻對靜脈葡萄糖耐受測試中葡萄糖相關指標的影響：葡萄糖半衰期（t_1/2）、清除率（CR）、降至最低點所需時間（T）和葡萄糖曲線下面積（AUC）

1 處理分別為對照組（0 毫克鉻）、5、10或15毫克/天丙酸鉻源的鉻。

圖一 丙酸鉻對荷斯坦小母牛靜脈葡萄糖耐受測試中葡萄糖清除的影響（左：葡萄糖絕對濃度，mg/dL；右：與其礎值的百分比。各時間點的平均SEM值為1.61mg/dL或平均值的2.0%）

結果表明丙酸鉻改善了胰島素敏感性的葡萄糖吸收機制，其可能機理為：鉻結合一個小分子量的小肽，在胰島素與其受體結合之后提高了胰島素的活性，從而提高了葡萄糖轉運蛋白（可能為葡萄糖轉運蛋白4，GLUT4）向細胞膜的轉運（Shepher和Kahn, 1999; Cefalu等, 2002）。葡萄糖的清除率和曲線下面積結果（圖2）表明影響是協(xié)同的：清除率增加，與此同時曲線下面積減小。

圖二 丙酸鉻對荷斯坦小母牛靜脈測試中葡萄糖清除率和曲線下面積的影響（柱形圖：曲線下面積，mg/dL*min；線形圖：清除率，%/min。曲線下面積的平均SEM值為70.2mg/dL*min或平均值的1.2%；清除速度的平均SEM值為70.2mg/dL*min或平均值的4%）

對胰島素的影響

葡萄糖灌注后血清中胰島素水平迅速增加至峰值，達到基礎值的3-4倍（表四，圖3），由于各胰島素變量均進行了處理，各組之間沒有統(tǒng)計上的顯著差異。胰島素清除率與葡萄糖清除率結果類似，表明組織中的胰島素敏感性提高。通過測試及分析第4試驗期對照組胰島素濃度，并與前3個試驗期的結果相比，發(fā)現(xiàn)試驗期與處理之間存在互作效應，第4個試驗期的對照組結果是最低的（P<0.05,只對對照組分析試驗期的影響時的所有時間點）。

¹ 處理分別為對照組（0 毫克鉻）、5、10或15毫克/天丙酸鉻源的鉻。2 指標：t_1/2=半衰期，CR=清除率，T=降至最低葡萄糖濃度所需時間，AUC=葡萄糖曲線下面積

圖三 丙酸鉻對荷斯坦小母牛靜脈測試中胰島素的影響（左：試驗全期；右：試驗期1-3。各時間點的平均SEM值為1.64μIU/mL或平均值的217%）

體外葡萄糖耐受測試時，葡萄糖消失率更快但胰島素清除率沒有變化，表明組織水平上的胰島素敏感性更高。第4個試驗期對照組的胰島素濃度顯著低于前3個試驗期的處理組，而第4個試驗對照組的試驗動物在之前6周已經(jīng)飼喂了3個連續(xù)劑量的丙酸鉻，且我們在試驗設計時已經(jīng)平衡了報道中可能存在的持續(xù)效應（NRC, 1997; McNamara和Valdez, 2005），所以如果該影響確實存在，則表明添加丙酸鉻可能對胰島素的敏感性具有長期效應。該作用需要進一步的證實，其可能機理是機體中鉻的貯存增加或胰腺的敏感性得到了提高。

對NEFA的影響

葡萄糖耐受測試中NEFA的變化與預期一致（圖四，表五）：最初由于試驗操作產生的應激而輕微升高，葡萄糖灌注后隨著葡萄糖水平的增加而降低，最后由于葡萄糖水平的降低而增加至初始水平。沒有適當?shù)囊蛩貋砗饬勘徙t對NEFA變化率的影響，但處理組NEFA水平呈現(xiàn)降低的趨勢（P=0.08，表五）。

圖四 丙酸鉻對荷斯坦小母牛靜脈葡萄糖耐受測試中非酯脂肪酸（NEFA）的影響

1 處理分別為對照組（0 毫克鉻）、5、10或15毫克/天丙酸鉻源的鉻。

以往對單胃動物補飼鉻的研究結果一致表明：鉻可提高葡萄糖的耐受和NEFA的濃度（NRC, 1997; Matthews等，2001，2003），但反芻動物上的研究結果不太一致，許多研究表明鉻可輕微提高幼年動物的葡萄糖清除率，而一些研究則發(fā)現(xiàn)幾乎沒有什么影響（NRC, 1997; Depew等，1998；Bunting等，2000）。近期對有機鉻如蛋氨酸鉻和丙酸鉻的研究結果則較為一致：可提高妊娠晚期和泌乳期動物的葡萄糖清除率（Hayirli等，2001；McNamara和Valdez，2005）。在妊娠晚期和泌乳早期給動物供給大量的葡萄糖，就可能得到如此結果（McNamara, 2005）。這些研究結果表明效價更高的有機鉻可提高反芻動物胰島素敏感組織對葡萄糖的吸收。

鉻以含鉻生物活性蛋白（Chromodulin）的形式參與胰島素敏感細胞對葡萄糖的吸收過程，含鉻活性蛋白（Chromodulin）是近期對一種低分子量鉻結合蛋白的建議命名（Sun等，2000）。含鉻生物活性蛋白（Chromodulin）以其無金屬去輔基的形式貯存于胰島素依賴性細胞內，在響應胰島素時，鉻從血中代謝并被轉運進這些細胞。鉻離子進入細胞后形成含鉻生物活性全蛋白，結合于胰島素受體的活性結構上，從而擴增受體酪氨酸激酶的活性，提高信號的強度及持續(xù)時間（Jacquamet等，2003），最終增大胰島素敏感性并將更多的葡萄糖轉運至胰島素敏感性組織，如脂肪和肌肉組織。此即為動物補充鉻后葡萄糖耐受提高的原因。

迄今還有沒有有關鉻對肌肉和脂肪組織的影響的研究。我們過去的工作發(fā)現(xiàn)，對產前21天至產后35天的奶牛補充丙酸鉻可大幅度（數(shù)倍）提高其脂肪細胞在體外培養(yǎng)時的脂肪合成速度（McNamara和Valdez，2005），脂肪降解速度則降低約10-15%，同時，釋放到機體中的游離脂肪酸降低約200克/天（McNamara, 2005）。這些結果表明代謝速度發(fā)生了很大的變化，對反芻動物的這些代謝途徑有一個快速且大幅度的調節(jié)（McNamara和Hillers, 1986; McNamara, 2005）。鉻還提高了奶牛的采食量和產奶量（McNamara和Valdez, 2005）。盡管現(xiàn)在還存在“誰先發(fā)生”的問題，但以下理論似乎是比較合理的：鉻提高脂肪組織對葡萄的吸收，從而降低脂肪的降解，進而導致采食速度增加，最終提高產奶量。未來的工作將可能有助于確認或推翻該理論和鉻在脂肪及肌肉組織中的作用機理。

小結

經(jīng)口服補充5-15毫克/天的鉻提高了生長母牛對葡萄糖的利用。在標準靜脈葡萄糖耐受測試中，與葡萄糖清除相關的測試結果均表明葡萄糖清除率提高，葡萄糖從血液向組織中的轉運（灌注后的曲線下面積）增加。兩個最主要的胰島素敏感性器官為肌肉和脂肪，盡管在本試驗日齡的母牛中，葡萄糖進入脂肪細胞的量得到了提高，但肌肉可能是最主要的葡萄糖轉運對象。高葡萄糖利用率（t1/2;降到最低值所需時間）和大的曲線下面積，以及不變或稍低的胰島素水平說明丙酸鉻提高了動物對胰島素的外圍響應。

參考文獻